Biomedical Chemistry: Research and Methods, 2022, 5(4), e00177

Стандартизация препаратов рекомбинантной CRISPR/Cas13a-нуклеазы с использованием РНКазы А с известной активностью

Л.К. Курбатов, С.П. Радько*, С.А. Хмелева, О.С. Тимошенко, А.В. Лисица

Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В. Н. Ореховича, 119121, Москва, ул. Погодинская, 10; e-mail: radkos@yandex.ru

Ключевые слова: Cas13a-нуклеаза; удельная активность; стандартизация; РНКаза А

DOI:10.18097/BMCRM00177

Полная версия статьи доступна на английском языке.

Предложен подход к характеризации препаратов рекомбинантной Cas13a-нуклеазы в терминах удельной коллатеральной активности для их стандартизации. Стандартизация препаратов Cas13a-нуклеазы по удельной активности будет полезна как при разработке тестов, использующих коллатеральную рибонуклеазную активность Cas13a, так и для оптимизации процедур экспрессии, очистки и хранения рибонуклеазы. Подход основан на измерении начальной скорости расщепления специально созданных и коммерчески доступных образцов молекул РНК (FQ-репортеров, меченных флуорофором и химическим соединением – гасителем флуоресценции) препаратом рекомбинантной Cas13a-нуклеазы и коммерческой РНКазой А с известной активностью. В качестве предварительного условия необходимо найти оптимальное молярное соотношение для образования комплексов Cas13a с направляющей РНК (нРНК), а также оптимальное количество РНК-мишени. Использование синтетической РНК-мишени (сРНК) представляется предпочтительным по сравнению с препаратами суммарной РНК (тРНК).

Рисунок 1. Характерные кинетические кривые расщепления FQ-репортеров РНКазой А: зависимости флуоресценции от времени инкубации образцов с различным количеством РНКазы А. Активность РНКазы А (U) в образце объемом 50 мкл: 1 – 3·10-8, 2 – 10·10-8, 3 – 27·10-8.
Рисунок 2. Зависимость начальной скорости расщепления FQ-репортеров от количества активности РНКазы А в образце. Показаны средние значения и соответствующие стандартные ошибки для трех независимых измерений.
Рисунок 3. Характерные кинетические кривые расщепления FQ-репортеров как результат коллатеральной активности Cas13a-нуклеазы: зависимости флуоресценции от времени инкубации образцов с различным количеством сРНК. Количество сРНК в образце объемом 50 мкл: 1 – 2.3 нг; 2 – 4.5 нг; 3 – 9 нг. Концентрация Cas13a – 100 нМ; молярное отношение нРНК/Cas13a – 4.
Рисунок 4. Зависимость начальной скорости расщепления FQ-репортеров от концентрации нРНК в образце. Концентрация Cas13a – 100 нМ; количество тРНК в образце объемом 50 мкл – 100 нг. Показаны средние значения и соответствующие стандартные ошибки для трех независимых измерений.
Рисунок 5. Зависимость начальной скорости расщепления FQ-репортеров от количества тРНК в образце объемом 50 мкл. Концентрации Cas13a и нРНК – 100 и 400 нМ, соответственно. Показаны средние значения и соответствующие стандартные ошибки для трех независимых измерений.
Рисунок 6. Зависимость начальной скорости расщепления FQ-репортеров от количества нРНК в образце объемом 50 мкл. Концентрации Cas13a и нРНК – 100 и 400 нМ, соответственно. Показаны средние значения и соответствующие стандартные ошибки для трех независимых измерений.
Рисунок 7. Начальная скорость расщепления FQ-репортеров как функция количества комплексов нРНК/Cas13a в образце объемом 50 мкл. Количество комплексов представлено как количество белка. Молярное отношение нРНК/Cas13a равно 4; количество сРНК в образце – 30 нг. Показаны средние значения и соответствующие стандартные ошибки для трех независимых измерений.

ЗАКРЫТЬ
Таблица 1. ДНК-олигонуклеотиды, использованные как матрицы для синтеза нРНК и сРНК. Последовательность, комплементарная последовательности Т7-промотора, показана курсивом. Самокомплементарные последовательности ДНК-олигонуклеотидов выделены жирным шрифтом.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской федерации в рамках Федеральной научно-технической программы развития генетических технологий на 2019-2027 годы (соглашение №075-15-2021-1345, уникальный идентификатор проекта RF----193021X0012).

К данной статье приложены дополнительные материалы, свободно доступные в электронной версии (http://dx.doi.org/10.18097/BMCRM00177) на сайте журнала.

ЛИТЕРАТУРА

  1. Zamani, M., Furst, A.L., Klapperich,C.M. (2021) Strategies for engineering affordable technologies for point-of-care diagnostics of infectious diseases. Accounts of Chemical Research, 54(20), 3772-3779. DOI
  2. Ivanov, A.V., Safenkova, I.V., Zherdev, A.V., Dzantiev, B.B. (2021) The potential use of isothermal amplification assays for in-field diagnostics of plant pathogens. Plants (Basel), 10(11), 2424. DOI
  3. Zhao, Y., Chen, F., Li Q., Wang, L., Fan, C. (2015) Isothermal Amplification of Nucleic Acids. Chemical Reviews, 115(22), 12491-12545. DOI
  4. van Dongen, J.E., Berendsen, J.T.W., Steenbergen, R.D.M., Wolthuis, R.M.F., Eijkel, J.C.T., Segerink, L.I. (2020) Point-of-care CRISPR/Cas nucleic acid detection: Recent advances, challenges and opportunities. Biosensors and Bioelectronics, 166, 112445. DOI
  5. Kaminski, M.M., Abudayyeh, O.O., Gootenberg, J.S., Zhang, F., Collins, J.J. (2021) CRISPR-based diagnostics. Nature Biomedical Engineering, 5(7), 643–656. DOI
  6. Ozay, B., McCalla, S.E. (2021) A review of reaction enhancement strategies for isothermal nucleic acid amplification reactions. Sensors and Actuators Reports, 3, 100033. DOI
  7. Wu, W.Y., Lebbink, J.H.G., Kanaar, R., Geijsen, N., van der Oost, J. (2018) Genome editing by natural and engineered CRISPR-associated nucleases. Nature Chemical Biology, 14(7), 642-651. DOI
  8. Kim, S., Ji, S., Koh, H.R. (2021) CRISPR as a Diagnostic Tool. Biomolecules, 11(8), 1162. DOI
  9. Abudayyeh, O.O., Gootenberg, J.S., Konermann, S., Joung, J., Slaymaker, I.M., Cox, D.B., Shmakov, S., Makarova, K.S., Semenova, E., Minakhin, L., Severinov, K., Regev, A., Lander, E.S., Koonin, E.V., Zhang, F. (2016) C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science, 353(6299), aaf5573. DOI
  10. Gootenberg, J.S., Abudayyeh, O.O., Lee, J.W., Essletzbichler, P., Dy, A.J., Joung, J., Verdine, V., Donghia, N., Daringer, N.M., Freije, C.A., Myhrvold, C., Bhattacharyya, R.P., Livny, J., Regev, A., Koonin, E.V., Hung, D.T., Sabeti, P.C., Collins, J.J., Zhang, F. (2017) Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science, 356(6336), 438-442. DOI
  11. Kurbatov, L.K., Radko, S.P., Kravchenko, S.V., Kiseleva, O.I., Durmanov, N.D., Lisitsa, A.V. (2020) Single stage purification of CRISPR/cas13a nuclease via metal-chelating chromatography following heterologous expression with the preservation of collateral ribonuclease activity. Applied Biochemistry and Microbiology, 56(6), 671–677. DOI
  12. Zhu, H., Richmond, E., Liang, C. (2018) CRISPR-RT: A web application for designing CRISPR-C2c2 crRNA with improved target specificity. Bioinformatics, 34(1), 117-119. DOI
  13. Bisswanger, H. (2013) Practical Enzymology. Wiley-Blackwell, 376 p.
  14. Polygina, G.V., Cherednichenko, V.S., Rimareva, L.V. (2003) Opredelenie aktivnosti fermentov. DeLi print, Moscow, 376 p.