|
Сравнение результатов SPR анализа взаимодействия антиген-антитело, выполненного с помощью биосенсоров Biacore X-100 («Cytiva», США) и MI-S200D («Inter-Bio», Китай) Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича, Россия, 119121, Москва, Погодинская ул. 10 стр. 8; *e-mail: gnedenko.oksana@gmail.com Ключевые слова: поверхностный плазмонный резонанс (SPR); оптические биосенсоры; взаимодействие антиген-антитело; константы скорости образования и распада комплекса (kon, koff); равновесная константа диссоциации (Kd) DOI: 10.18097/BMCRM00246 ВВЕДЕНИЕ Поверхностный плазмонный резонанс (SPR от англ. surface plasmon resonance) — это признанный аналитический метод, позволяющий исследовать взаимодействие нативных молекул в реальном времени без использования меток и дополнительных сопряженных процессов. Из анализа сенсограмм получают данные о кинетике, аффинности, специфичности и термодинамике межмолекулярных взаимодействий. Метод позволяет выполнять исследования с меньшим расходом материалов и более высокой производительностью по сравнению со многими другими биофизическими методами. Общий принцип работы биосенсоров на эффекте SPR состоит в детекции взаимодействия молекул аналита, находящегося в растворе, с молекулами лиганда, иммобилизованными на поверхности сменного оптического чипа. В настоящее время существуют различные коммерческие платформы SPR с разными уровнями автоматизации, производительности и чувствительности обнаружения, широко распространённые в фармацевтической и биотехнологической промышленности в качестве основных аналитических инструментов. В течение примерно трёх десятилетий SPR-биосенсоры использовали для характеристики взаимодействий антиген-антитело [1–4], что имеет важное значение для успешной разработки лекарств. SPR-биосенсоры — золотой стандарт для измерения аффинности связывания и кинетики межмолекулярных взаимодействий — используются на ее различных этапах [5–7]. К таким биосенсорам относятся биосенсоры Biacore («Cytiva», США). В настоящее время из-за ограничения импорта западного высокотехнологичного оборудования исследователям в нашей стране стали не доступны как новые SPR биосенсоры, так и запчасти и расходные материалы к ранее купленным. Поэтому крайне актуален вопрос перехода на научные приборы, произведенные в Китае. При этом возникает вопрос о сопоставимости экспериментальных данных, полученных с помощью SPR-биосенсоров, произведенных в Китае, с данными, полученными на приборах от американских или европейских брендов. В литературе есть публикации о сравнении технических характеристик биосенсоров от разных производителей из США [8, 9]. В то же время отсутствуют данные по сравнению Biacore X-100 («Cytiva», США) и MI-S200D («Inter-Bio», Китай). Целью работы было сравнение кинетики и аффинности связывания антител с белком А с помощью двух современных платформ SPR: Biacore X-100 («Cytiva», США) и MI-S200D («Inter-Bio», Китай). Для сравнения двух SPR-биосенсоров мы выбрали хорошо изученную высоко аффинную пару белков - белок A/IgG. Данная пара также широко используется в области биотехнологии, например, для ориентированной иммобилизации антител на носителе через белок А [10]. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использовали белок А от фирмы «ИМТЕК» (Россия). Моноклональные антитела мыши к иммуноглобулинам G и G1 человека, изотипы IgG2a и IgG1, соответственно (кат. № 1G1cc клоны 5А9сс и 2С11сс) были получены от фирмы “Хайтест” (Россия). Анализ взаимодействия антител (IgG2а и IgG1) с белком А выполняли на оптических биосенсорах Biacore X-100 и MI-S200D, работающих на эффекте поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Сигнал биосенсора Biacore X-100 регистрировали в резонансных единицах RU (1 RU соответствует связыванию 1 пг белка на поверхности оптического чипа). Сигнал биосенсора MI-S200D регистрировали в градусах резонансного угла millidegree (m°). Были использованы чипы CM5 («Cytiva») и IB CM5 («Inter-Bio»), покрытые карбоксиметилированным декстраном. Все измерения проводили при температуре 25°С. В работе были использованы следующие реактивы от фирмы «Cytiva» (США): рабочий буфер HBS-EP+ (150 мМ NaCl, 3 мМ ЭДТА, 0.05% детергент P20, 10 мМ HEPES, pH 7.4), набор реагентов для ковалентной иммобилизации белков за первичные аминогруппы (EDC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид-HCl), N-гидроксисукцинимид (NHS), 1 М этаноламин-HCl, pH 8.5)), набор 10 мМ ацетатных буферов (рН 4.0, 4.5, 5.0), 10 мМ глициновый буфер, рН 2.5. Для работы с китайским биосенсором были использованы аналогичные реагенты, полученные от фирмы «Inter-Bio» (Китай). Иммобилизация белка А на чип CM5 Иммобилизацию белка А осуществляли путём формирования ковалентных связей между карбоксильными группами на поверхности оптического чипа СМ5 и аминогруппами белка А. Карбоксильные группы чипа активировали инжекцией смеси 0.2 М EDC/0.05 М NHS в течение 7 мин при скорости потока 10 мкл/мин. Инжекцию раствора белка А (100 мкг/мл) в 10 мМ ацетатном буфере (рН 4.5) выполняли со скоростью 5 мкл/мин в течение 7 мин. Непрореагировавшие активированные группы блокировали 1 M этаноламином (pH 8.5) в течение 3 мин при скорости потока 10 мкл/мин. В качестве рабочего буфера использовали HBS-EP+. Уровень иммобилизации белка А составил порядка 3000 RU (равно примерно 3 нг белка-лиганда). Иммобилизация белка А на чип IB CM5 Иммобилизацию белка А на чип IB CM5 осуществляли по аналогичному протоколу путём формирования ковалентных связей между карбоксильными группами на поверхности чипа и аминогруппами белка А. Уровень иммобилизации белка А составил 375 m° (равно примерно 3,5 нг белка-лиганда). Исследование белок-белковых взаимодействий Регистрацию взаимодействий антител с иммобилизованным белком А выполняли в режиме реального времени путём последовательных инжекций растворов антител в диапазоне концентраций от 10 нМ до 1 мкМ через контрольный (без белка) и рабочий (с белком) каналы оптических биосенсоров в течение 5 мин при скорости потока 10 мкл/мин. После каждого измерения поверхности оптических чипов регенерировали инжекциями 10 мМ глицинового буфера (pH 2.5) в течение 30 с при скорости потока 30 мкл/мин. В качестве рабочего буфера использовали HBS-EP+. Полученные наборы сенсограмм были обработаны с помощью программы Biaevaluation 4.1.1 (модель взаимодействия 1:1 Langmuir binding) и программного обеспечения Inter-Bio MI-S200D. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Техническое сравнение биосенсоров и получаемых данных Для корректного сравнения Biacore X-100 и MI-S200D необходимо иметь представление о некоторых основных характеристиках биосенсоров: объем пробы, базовый уровень шума (для обеспечения наилучшего соотношения сигнал/шум), рабочий диапазон температур (для измерений термодинамических параметров), диапазон скоростей потока (важно для оценки кинетических констант взаимодействия). Основные подобные характеристики представлены в таблице 1.
Из таблицы видно, что SPR-биосенсоры Biacore X-100 и MI-S200D относятся к одному классу приборов (проточные двухканальные биосенсора) и имеют очень близкие характеристики. Сравнение технических и конструктивных особенностей биосенсоров Biacore X-100 и MI-S200 Внешний вид биосенсоров представлен на рисунке 1.
По внешнему виду видно, что биосенсоры Biacore X-100 и MI-S200D имеют сходную конструкцию и компоновку: у обоих биосенсоров присутствуют турель для загрузки образцов, шприцевой насос, люк для установки оптического чипа («чипоприемник») и прочее. В то же время, конструкции оптических чипов принципиально отличаются. Сравнение оптических чипов биосенсоров Biacore X-100 и MI-S200D На рисунках 2 и 3 представлены фотографии чипов к биосенсорам Biacore X-100 и MI-S200D, соответственно.
Чип Biacore СМ5 представляет собой стеклянную пластинку размером 1 см2 с золотым напылением и карбоксиметилдекстрановым покрытием, вклеенную в пластиковый держатель, который размещается в пластмассовом пенале (рис. 2). При докировании чипа в биосенсоре к свободной стороне стеклянной пластинки прижимается оптический интерфейс призмы, а к другой стороне с золотым напылением и декстрановым покрытием прижимается интегральный жидкостной картридж, формирующий проточные микрофлюидные каналы. В отличие от чипа Biacore СМ5, чип IB-CM5 имеет более сложную конструкцию, содержащую уже сформированные проточные микрофлюидные каналы. Вся конструкция базируется на использовании одноразовой стеклянной призмы, на грани которой нанесено золотое напыление и приклеена пластиковая микрофлюидная система с двумя проточными каналами (рис. 3). Чип устанавливается в прибор без пенала. На рисунке 4 представлено схематическое объяснение принципиальных отличий конструкций оптических чипов двух SPR биосенсоров.
Экспериментальное сравнение получаемых данных На основе анализа серий сенсограмм, полученных на обоих приборах при инжекции растворов антител в разных концентрациях были определены кинетические константы взаимодействия антител с иммобилизованным на чипах белком А. Типичные сенсограммы показаны на рисунке 5.
Полученные величины кинетических констант и равновесной константы диссоциации молекулярных комплексов приведены в таблице 2. Значения Kd, полученные на обоих приборах, при взаимодействии IgG2а с белком А существенно ниже по сравнению с IgG1. Это полностью согласуется с литературными данными [13]. Можно видеть, что значения константы скорости ассоциации (kon), полученные на разных приборах, для IgG2а различаются всего на 2%, в то время как значения константы скорости диссоциации (koff) значительно различаются (на 51%). Соответственно и значения равновесной константы диссоциации (Kd) различаются на 52%. В случае IgG1 значения kon различаются на 20%, а значения koff различаются незначительно (на 1.3%). Соответственно и значения Kd в этом случае различаются на 21%.
Сравнение работы биосенсоров на основе оценки характеристик взаимодействия антиген-антитело, является традиционным для данного оборудования. Знание кинетических параметров межмолекулярных взаимодействий крайне важно для разработки лекарств. Например, в статье [9] сравнивали четыре биосенсора: Biacore T100 («Cytiva», США), ProteOn XPR36 («Bio-Rad», США), Octet RED 384 («ForteBio», CША) и IBIS MX96 («Wasatch Microfluidics», США). Кинетика связывания десяти высоко аффинных моноклональных антител с одним и тем же антигеном была одновременно оценена на этих биосенсорных платформах. Порядки констант скорости ассоциации и диссоциации хорошо коррелировали между этими инструментами. В статье [8] было выполнено сравнение кинетики связывания антигена с 23 антителами на Biacore 8K («Cytiva», США) и Carterra LSA («Carterra», США). Две платформы давали почти идентичные результаты, что делает их надежными инструментами для ускорения характеристики библиотек антител. В нашем случае порядок констант скорости ассоциации, полученных на обоих приборах для двух антител, совпадает. Для антител IgG1 практически совпадают константы скорости диссоциации. Оба прибора дают высококачественные данные, которые хорошо описывались простой моделью 1:1 (Langmuir binding). ЗАКЛЮЧЕНИЕ Нами было выполнено сравнительное исследование межмолекулярных взаимодействий с использованием оптических биосенсоров Biacore X-100 и MI-S200D. Это исследование будет полезно исследователям, работающим в условиях санкций. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что оба прибора дают высококачественные данные. Равновесные константы диссоциации Kd комплексов антител с иммобилизованным белком А, как для антител IgG2а, так и для антител IgG1, имеют одинаковый порядок. Данное исследование подтвердило практически полную взаимозаменяемость биосенсоров Biacore X-100 и MI-S200D. СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей или с использованием животных в качестве объектов. ФИНАНСИРОВАНИЕ Работа была выполнена в рамках Программы фундаментальных научных исследований в Российской Федерации на долгосрочный период (2021 - 2030 годы) (№122030100168 2). КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. ЛИТЕРАТУРА
|
