|
СОДЕРЖАНИЕ СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ Рисунок 1Влияние различных концентраций TNC на миграционную активность культуры клеток DF-1. Рисунок 2Результаты анализа миграционной активности при воздействии TNC по данным теста «царапины». Рисунок 3Время удвоения популяции клеток. Рисунок 4Уровни коллагена I типа в кондиционной среде после инкубации дермальных фибробластов с TNC. |
ВЛИЯНИЕ МАТРИКЛЕТОЧНОГО БЕЛКА ТЕНАСЦИНА-С НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ФИБРОБЛАСТОВ В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ ПОВРЕЖДЕНИЯ IN VITRO
Кубанский государственный медицинский университет, Ключевые слова: тенасцин-С; фибробласты; заживление ран; матриклеточные белки, коллагеногенез; алармин DOI: 10.18097/BMCRM00286 ВВЕДЕНИЕ Репаративные процессы в коже представляют собой сложные, многоступенчатые события, в которых ключевую роль занимают фибробласты, обеспечивающие восстановление внеклеточного матрикса (ВКМ), синтез коллагена, а также регулирующие клеточную миграцию, пролиферацию и ремоделирование тканей. Эффективность репарации во многом зависит от регуляции активности фибробластов различными биологически активными молекулами, включая компоненты ВКМ и провоспалительные сигналы [1]. Ключевыми составляющими репарационной активности фибробластов являются их миграционные, пролиферативные и секреторно-синтетические свойства. На ранних этапах репаративного процесса определяющее значение имеет миграционная способность клеток, обеспечивающая их направленное перемещение в очаг повреждения под действием хемотаксических стимулов. На последующей фазе репаративного ответа ключевую роль играет пролиферация фибробластов, приводящая к увеличению клеточной популяции в зоне повреждения [2]. Существенную роль играет и синтетическая активность фибробластов, реализующаяся в продукции компонентов ВКМ, включая коллагены I и III типов, фибронектин и протеогликаны, формирующие структурный каркас в зоне повреждения [3]. Эффективность регенеративного ответа определяется согласованным протеканием этих процессов, тогда как нарушения на любом из этапов – снижение миграционной активности, ограничение пролиферации или дефицит синтеза коллагена – ассоциируются с замедленным или патологическим заживлением [4]. Среди компонентов ВКМ особое внимание привлекает тенасцин-C (TNC) – матриклеточный белок, который синтезируется преимущественно в зонах тканевого повреждения, воспаления и активного ремоделирования, а его уровень меняется в зависимости от стадии репаративного процесса [5]. Функциональная пластичность TNC реализуется за счёт наличия множества доменов и альтернативного сплайсинга, обеспечивающих широкий спектр взаимодействий с клеточными рецепторами и компонентами внеклеточного матрикса [1, 6]. В ряде исследований показано, что он способен как стимулировать, так и ингибировать клеточную миграцию, пролиферацию и синтез компонентов матрикса, в зависимости от клеточного типа, микросреды и структуры доменов молекулы [7, 8]. Несмотря на активное изучение, механизм регуляции репарационной активности фибробластов под действием различных концентраций TNC остаётся недостаточно охарактеризованным. Помимо компонентов ВКМ, важное значение в контексте регенерации кожи имеют алармины – молекулы, высвобождаемые в ответ на повреждение тканей и запускающие неспецифические иммунные и воспалительные реакции [6]. К числу таких аларминов относится интерлейкин-1 альфа (IL1α) – провоспалительный цитокин, синтезируемый в ранние фазы заживления ран. IL1α способен изменять функции фибробластов, усиливая их миграционную и синтетическую активность, а также взаимодействовать с компонентами ВКМ, модулируя их эффект [9]. Учитывая предполагаемую роль TNC в ремоделировании кожи и его возможное взаимодействие с провоспалительными сигналами, представляет интерес комплексное исследование действия TNC на фибробласты как в изолированных условиях, так и в присутствии предварительного воспалительного стимула. Целью данной работы было определить оптимальную концентрацию TNC, способствующую стимуляции миграционной и синтетической активности фибробластов кожи человека in vitro, в том числе в условиях предварительной воспалительной активации с помощью IL1α. МЕТОДИКА Материалы В эксперименте была использована клеточная линия человеческих фибробластов линии DF-1 (кожа век взрослого донора), полученная из коллекции культур клеток позвоночных (ИНЦ РАН, Санкт-Петербург, Россия), паспортизированная и подтверждённая по морфологическим и молекулярным критериям. Клетки культивировали в полной питательной среде (ППС), содержащей модифицированную среду Игла Дульбекко (DMEM, «Bioinnlabs», Россия), дополненную 10% (объём/объём) эмбриональной сывороткой крупного рогатого скота («Биолот», Россия) и 1% (объём/объём) антибиотик-антимикотиком (пенициллин-стрептомицин, «Биолот») при 37°C в атмосфере 5% CO2. Коммерчески доступный рекомбинантный человеческий TNC («Cloud-clone Corp.», Китай) применяли в концентрациях 0.05 мкг/мл, 0.2 мкг/мл и 1 мкг/мл. Рабочие растворы готовили непосредственно перед добавлением в культуральную среду. Контролем служили клетки, которые инкубировали без добавления TNC. С целью имитации тканевого повреждения и запуска сигнальных путей врождённого иммунного ответа применяли интерлейкин-1 альфа (IL1α) («Cloud-clone Corp.») в концентрации 50 нг/мл, рассматриваемый как алармин [10]. Фибробласты предварительно инкубировали с IL1α в течение 24 ч при 37°C, после чего в ту же (не заменённую) кондиционную среду добавляли TNC в указанных концентрациях. Были сформированы следующие экспериментальные группы:
Иммуноферментный анализ Для количественного определения концентрации коллагена I типа в кондиционной среде использовали метод твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Супернатанты собирали после 48 ч инкубации с исследуемыми веществами и хранили при -20°C до анализа. Концентрации коллагена I типа определяли с использованием коммерчески доступных наборов ELISA («Cloud-clone Corp.», Китай), согласно инструкции производителя. Оптическую плотность измеряли при 450 нм с использованием многофункционального ридера для микропланшетов FilterMax F5 («Molecular Devices», США). Анализ миграционной активности фибробластов Миграционную активность клеток оценивали с использованием метода «царапины», позволяющего количественно определить способность клеток к латеральной миграции в условиях in vitro [11]. Метод основан на регистрации скорости закрытия искусственно созданного линейного дефекта в клеточном монослое за счёт миграции клеток в зону повреждения. Клетки дермальных фибробластов 3-го пассажа высевали в 48-луночные планшеты («Corning», США) в плотности, обеспечивающей формирование плотного монослоя (2×102 клеток/лунку), в течение 24 часов культивирования при стандартных условиях (37°C, 5% CO2, ППС). После достижения 90-100% конфлюентности культуральную среду удаляли, клетки дважды промывали стерильным фосфатно-солевым буфером (PBS, pH 7.4, «Биолот»), после чего в центральной части каждой лунки наносили линейное механическое повреждение монослоя с помощью стандартного стерильного наконечника для автоматической пипетки (наконечник 200 мкл, диаметр узкого отверстия 0.45±0.04 мм). Изменение площади «царапины» фиксировали через 0 и 24 ч с использованием камеры-адаптера 60N-C 1×1.0 («TOURTEK», Китай). Количественный анализ полученных изображений проводили с использованием программы ImageJ/Fiji со встроенным плагином Wound healing size tool, позволяющим автоматически рассчитывать площадь «царапины». Миграционную активность рассчитывали по формуле S0-S24/S0 x 100%, где S0 и S24 – площадь области, свободной от клеток в нулевой точке и через 24 ч. Оценка пролиферативной активности (PDT-тест) Для количественной оценки пролиферативной активности фибробластов человека использовали метод расчёта времени удвоения популяции клеток – PDT-тест (population doubling time). Клетки высевали в 12-луночные планшеты в плотности 5×102 клеток/см². Инкубацию проводили в течение 72 ч в стандартных условиях культивирования. По окончании инкубации клетки промывали PBS без Ca2+ и Mg2+ («Биолот»), открепляли с помощью раствора Трипсина-Версена 1:1 («Биолот»), и подсчитывали их концентрацию в автоматическом счётчике клеток С-100 («RWD», Китай). Расчёт PDT производился по формуле: PDT = (t × log2) / (logNt – logN0) где t – время культивирования (ч), N0 –число клеток на момент посева, Nt – число клеток на момент снятия. Каждое измерение проводилось в трёх независимых повторах. Статистический анализ Анализ полученных экспериментальных данных проводили, используя программное обеспечение Graph Pad Prism (version 6.04), Microsoft Office Excel 2016. Полученные данные были представлены в виде среднего значения (М) ± стандартного отклонения (SD). Статистическая значимость различий между группами оценивалась критерием Стьюдента, при уровне значимости p < 0.05. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ В условиях экспозиции высоких концентраций TNC (0.2 мкг/мл и 1 мкг/мл) наблюдалось более активное продвижение фибробластов в зону дефекта, сопровождаемое формированием выраженных ламеллоподий – структур, характерных для клеток с высоким уровнем миграционной активности. Напротив, в контрольной группе и при минимальной дозе TNC (0.05 мкг/мл) сохранялось значительное незакрытое пространство в зоне повреждения (рис. 1).
Воздействие TNC приводило к усилению миграционной активности фибробластов, измеряемой по площади закрытия «царапины». Эффект был выражен при концентрациях 0.2 мкг/мл и 1 мкг/мл, между которыми не зафиксировано значимых различий, что свидетельствует о достижении плато ответа (рис.2).
В условиях предварительной стимуляции фибробластов IL1α отмечено увеличение площади закрытия царапины по сравнению с группами без IL1α при концентрациях TNC 1 мкг/мл (p< 0.05) и 0.2 мкг/мл (p< 0.01). Это свидетельствует о повышении миграционной активности фибробластов под действием провоспалительного эффекта, особенно при применении умеренных (0.2 мкг/мл) и высоких (1 мкг/мл) концентрациях TNC, при этом дальнейшее повышение концентрации не приводило к статистически значимому усилению миграции. Для оценки пролиферативной активности фибробластов был проведён расчёт времени удвоения популяции клеток – PDT-тест, который характеризует способность клеток к активному делению, что имеет важное значение при заживлении повреждений кожи, требующих репопуляции кожного лоскута [12]. Применение TNC в условиях предварительно индуцированной воспалительной активации фибробластов с использованием IL1α способствовало значимому снижению времени удвоения популяции по сравнению с контролем, что отражает ускорение пролиферации клеток. Наибольший эффект был зафиксирован при концентрации 0.2 мкг/мл. Повышение дозировки до 1 мкг/мл не приводило к дальнейшему усилению эффекта, что может свидетельствовать о насыщении рецепторов или развитии адаптационного клеточного ответа (рис. 3).
Обнаруженный дозозависимый эффект TNC согласуется с существующими представлениями о его роли как важного модулятора клеточной динамики в контексте регенерации и ремоделирования тканей. Известно, что TNC может выступать как промиграционный фактор, активируя сигнальные каскады, вовлекающие FAK, Src, ERK1/2 и PI3K/Akt, а также повышая активность металлопротеиназ [13]. Одновременно, при достижении определённого порога концентрации, TNC реализует антиадгезивный эффект за счёт дестабилизации фокальных контактов и ингибирования взаимодействия клеток с компонентами внеклеточного матрикса, прежде всего с фибронектином [14]. Этот бифазный эффект может объяснять отсутствие дополнительной стимуляции клеточной миграции при увеличении концентрации TNC до 1 мкг/мл в настоящем исследовании. Таким образом, полученные результаты демонстрируют, что TNC индуцирует миграционную активность фибробластов DF-1 в пределах определённого концентрационного диапазона; при этом оптимальной дозой в условиях проведённого эксперимента следует считать 0.2 мкг/мл. Повышение концентрации выше этого значения не усиливает эффект, вероятно, вследствие включения механизмов, ограничивающих адгезию и направленное движение клеток. Эти данные подтверждают двойственную роль TNC в регуляции клеточной подвижности и подчеркивают его значимость как потенциального регулятора процессов репарации тканей. Анализ данных показал, что наибольшая продукция коллагена I типа наблюдалась при концентрации TNC 1 мкг/мл в условиях стимуляции IL1α. Отмечено статистически значимое увеличение уровня коллагена по сравнению как с соответствующей группой без IL1α, так и с контрольной группой (p< 0.05). При концентрациях TNC 0.2 мкг/мл и 0.05 мкг/мл также наблюдалась тенденция к повышению продукции коллагена в присутствии IL1α, однако выраженность эффекта была ниже по сравнению с дозой 1 мкг/мл (рис. 4).
Полученные данные согласуются с результатами других исследований, демонстрирующих, что TNC способен усиливать неоколлагеногенез, через активацию сигнальных путей, опосредованных интегриновыми рецепторами и молекулами TGF-β [15]. IL1α, как ключевой провоспалительный цитокин, оказывает многогранное влияние на клеточные функции, включая стимуляцию продукции коллагена, особенно в сочетании с другими компонентами матрикса или цитокинами [16]. Обнаруженные в настоящем исследовании высокие показатели продукции коллагена I типа при совместном воздействии IL1α и TNC согласуются с литературными данными об усилении воспалительной и ремодулирующей активности фибробластов при подобной стимуляции [13]. Повышение концентрации до 1 мкг/мл стимулирует активацию TGF-β/SMAD-сигнального пути и увеличивает экспрессию proCOL1A1, что ведёт к усиленному синтезу коллагена I типа – механизм, подтверждённый 3D культурой фибробластов и смещением баланса MMP-1/collagen в сторону потери целостности ВКМ [17]. Кроме того, известно, что TNC регулирует экспрессию генов, кодирующих компоненты внеклеточного матрикса, включая COL1A1, через активацию ERK1/2 [13]. Повышение концентрации TNC может стимулировать эти эффекты, индуцируя переход фибробластов в активированное состояние, схожее с миофибробластным фенотипом, характеризующимся высокой секреторной активностью. Полученные данные соответствуют известным механизмам регуляции фенотипа фибробластов в процессе заживления ран [18]. В условиях повреждения и под воздействием сигналов матриксного происхождения (в частности, TNC), фибробласты демонстрируют фенотипическую пластичность, переходя от миграционно-активного к секреторному состоянию [19]. Эти наблюдения отражают классический парный режим действия TNC: на низких дозах он стимулирует клеточную миграцию, а при более высоких синтез структурных белков ВКМ. Такой режим особенно актуален при ожогах, когда ранняя фаза заживления требует мобилизации клеток в зону повреждения, а затем интенсивного восстановления структуры дермального матрикса. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Проведённое исследование показало, что рекомбинантный TNC дозозависимо стимулирует миграционную и пролиферативную активность дермальных фибробластов человека in vitro, при этом наиболее выраженный эффект наблюдался при концентрациях 0.2 мкг/мл и 1 мкг/мл. Важно отметить, что TNC демонстрировал дозозависимый эффект: при 0.2 мкг/мл стимулировал миграцию, пролиферацию и повышал уровень коллагена I типа относительно контроля, при концентрации TNC 1 мкг/мл наблюдались более высокие концентрации коллагена в кондиционной среде, чем при воздействии 0.2 мкг/мл TNC, что может способствовать формированию келоидных рубцов. Установлено, что предварительная стимуляция фибробластов IL1α, моделирующим воспалительное микроокружение, приводило к статистически значимому усилению их ответа на последующее воздействие TNC. Усиление миграционной, пролиферативной и синтетической активности клеток после предварительной инкубации с IL1α свидетельствовало о том, что реализация эффектов TNC может опосредоваться воспалительными сигнальными механизмами. Эти данные позволяют рассматривать TNC как потенциальный регулятор клеточной активности в ранние фазы репаративного процесса, способный модулировать взаимодействие между провоспалительной стимуляцией и матрикс-зависимой активацией фибробластов. Дальнейшие исследования с использованием in vivo моделей необходимы для верификации полученных in vitro данных путем интеграции TNC в состав комбинированных систем доставки или биоактивных матриксов для стимуляции кожной регенерации. СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ Все процедуры, связанные с использованием клеточных линий, проводили в строгом соответствии с действующими национальными и международными этическими стандартами. Экспериментальную часть исследования осуществляли в соответствии с Приказом Министерства здравоохранения РФ от 1 апреля 2016 г. № 199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики» в условиях, исключающих загрязнение, с соблюдением принципов биобезопасности и в соответствии с руководящими документами по работе с клеточными культурами. Исследование получило одобрение независимого этического комитета Кубанского государственного медицинского университета (протокол №122 от 06.09.2023 г.). ФИНАНСИРОВАНИЕ Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда №24-25-20083, https://rscf.ru/project/24-25-20083/ и при финансовой поддержке Кубанского научного фонда в рамках проекта №24-25-20083. КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. ЛИТЕРАТУРА
|
