Biomedical Chemistry: Research and Methods, 2026, 9(1), e00302

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ, ДОПОЛНЯЮЩАЯ КОРОВУЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ПРОМОТОРА T7 С 3′-КОНЦА, В КОНСТРУИРОВАНИИ NASBA-ПРАЙМЕРОВ: ВЛИЯНИЕ НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ АМПЛИФИКАЦИИ

Хмелева1 С.А.*, Васильева1 Ю.А., Птицын1 К.Г., Курбатов1 Л.К., Тимошенко1 О.С., Супрун2 Е.В., Радько1 С.П., Лисица1 А.В.

1Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, 119121, Москва, Погодинская ул., 10; e-mail: khmelevaswetlana@yandex.ru
2Химический факультет Московского государственного унивеситета им. М.В.Ломоносова, Россия, 119991, Москва, Ленинские горы, 1/3

Ключевые слова: NASBA, промотер T7, конструирование праймеров, эффективность амплификации

DOI:10.18097/BMCRM00302

Полная версия статьи доступна на английском языке.

NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) – метод изотермической амплификации РНК, позволяющиq выявлять инфекционные агенты в лабораторных внелабораторных условиях. Он основан на присутствии промотора РНК-полимеразы фага T7 в одном из праймеров NASBA, и эффективность метода в значительной степени зависит от силы промотора. Известно, что при транскрипции in vitro сила промотора в значительной степени зависит от последовательности, расположенной непосредственно после коровой последовательности промотора T7. В данной работе эффективность NASBA была экспериментально оценена для различных вариантов 8-нуклеотидных последовательности, расположенной непосредственно после коровой последовательности промотора T7. Варианты были ранжированы по известным выходам РНК, образующейся при транскрипции in vitro. Было обнаружено, что ранг 8-нуклеотидного продления основной последовательности промотора T7 может служить основанием для рационального выбора последовательнойтей эффективных праймеров NASBA. При этом не все 8-нуклеотидные продления, характеризующиеся наибольшим выходом РНК при транскрипции in vitro, обеспечивают наиболее эффективную амплификацию РНК-мишеней в NASBA. Для выбора наилучших кандидатов в праймеры NASBA по-прежнему требуется тщательная оценка способности праймера образовывать вторичные структуры с использованием алгоритмов сворачивания ДНК.

Рисунок 1. Репрезентативные амплификационные кривые. NASBA проводилась с 0.1 пг суммарной РНК C. sepedonicus (10 000 копий рибосомальной РНК 16S) и различными наборами праймеров. Цвет кривой обозначает использованный вариант праймера Р1 (Табл. 1), как показано слева от рисунка. У контрольных проб (NTC, no template controls) амплификационные кривые практически совпадают. Горизонтальная линия, отмеченная как «Пороговый уровень», автоматически определялась программой амплификатора и использовалась для получения значений Cp (точки пересечения). у.е. – условные единицы.

Рисунок 2. Зависимости характеристического времени амплификации (tc) от относительной представленности для различных наборов NASBA-праймеров. Значения tc вычисляли, основываясь на значениях Cp и длительности цикла (0.5 мин, время между измерениями уровня флуоресценции). Значения относительной представленности взяты из табл. 1. Показаны средние арифметические значения и соответствующие среднеквадратичные отклонения для нескольких независимых экспериментов (от 3 до 5).

Рисунок 3. Суммарный выход РНК в реакции NASBA для вариантов праймера Р1, характеризующихся различными значениями относительной представленности (табл. 1). Показаны средние арифметические значения и соответствующие среднеквадратичные отклонения для нескольких независимых экспериментов (от 3 до 5).

Рисунок 4. Электрофоретический анализ продуктов NASBA. Репрезентативные электрофоретические гели. Электрофоретическая дорожки L – ДНК-стандарты. Молекулярный размер указан слева в нуклеотидах. Электрофоретические полосы, представляющие таргентные (специфические) РНК-ампликоны, отмечены стрелками. Панель А: дорожки с 1 по 7 – NASBA с праймерами P1_1, P1_155, P1_68, P1_4, P1_236, P1_355 и P1_444 (табл. 1) соответственно. Панель B: дорожки с 1 по 5 – NASBA с праймерами P1_513, P1_617, P1_700, P1_853 и P1_948 (Табл. 1), соответственно.

Рисунок 5. Выход целевых РНК-ампликонов в реакции NASBA с различными вариантами праймера Р1 как функция относительной представленности. Значения относительной представленности – как в Табл. 1. Выход представлен как полная интенсивность флуоресценции (в относительных единицах, у.е.) в электрофоретической полосе, соответствующей целевым ампликонам (как показано на рис. 4). Показаны средние арифметические значения и соответствующие среднеквадратичные отклонения для 3 независимых экспериментов.

ЗАКРЫТЬ
Таблица 1. Варианты праймера Р1, использованные в работе. Коровая последовательность промотора Т7 выделена синим шрифтом. Последовательность нуклеотидной вставки, влияющей на эффективность праймера в NASBA, выделена красным.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Работа выполнена в рамках Программы фундаментальных научных исследований в Российской Федерации на долгосрочный период (2021 - 2030 годы) (№ 122030100170-5).

ЛИТЕРАТУРА
  1. Bodulev, O.L., Sakharov, I.Y. (2020) Isothermal Nucleic Acid Amplification Techniques and Their Use in Bioanalysis. Biochemistry (Moscow), 85, 147–166. DOI
  2. Zhao, Y., Chen, F., Li, Q., Wang, L., Fan, C. (2015) Isothermal Amplification of Nucleic Acids. Chem. Rev., 115, 12491–12545. DOI
  3. Abel, G. (2015) Current status and future prospects of point-of-care testing around the globe. Expert Review of Molecular Diagnostics, 15, 853–855. DOI
  4. Hu, B., Guo, H., Si, H., Shi, Z. (2024) Emergence of SARS and COVID-19 and preparedness for the next emerging disease X. Frontiers in Medicine, 18, 1–18. DOI
  5. Yang, H., Ledesma-Amaro, R., Gao, H., Ren, Y., Deng, R. (2023) CRISPRbased biosensors for pathogenic biosafety. Biosensors and Bioelectronics, 228, 115189. DOI
  6. De Felice, M., De Falco, M., Zappi, D., Antonacci, A., Scognamiglio, V. (2022) Isothermal amplification-assisted diagnostics for COVID-19. Biosensors and Bioelectronics, 205, 114101. DOI
  7. Fernandes, R.S., De Oliveira Silva, J., Gomes, K.B., Azevedo, R.B., Townsend, D.M., De Paula Sabino, A., Branco De Barros, A.L. (2022) Recent advances in point of care testing for COVID-19 detection. Biomedicine and Pharmacotherapy, 153, 113538. DOI
  8. Deiman, B., van Aarle, P., Sillekens, P. (2002) Characteristics and applications of nucleic acid sequence-based amplification (NASBA). Molecular Biotechnology, 20, 163-179. DOI
  9. Honsvall, B.K., Robertson, L.J. (2017) From research lab to standard environmental analysis tool: Will NASBA make the leap? Water Resources, 109, 389-397. DOI
  10. Compton, J. (1991) Nucleic acid sequence-based amplification. Nature, 350, 91–92. DOI
  11. Tang, G.Q., Bandwar, R.P., Patel, S.S. (2005) Extended upstream A-T sequence increases T7 promoter strength. Journal of Biological Chemistry, 280, 40707-40713. DOI
  12. Romano, J.W., Williams, K.G., Shurtliff, R.N., Ginocchio, C., Kaplan, M. (1997) NASBA technology: isothermal RNA amplification in qualitative and quantitative diagnostics. Immunological Investigations, 26, 15–28. DOI
  13. Ju, Y., Kim, H.Y., Ahn, J.K., Park, H.G. (2021) Ultrasensitive version of nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) utilizing a nicking and extension chain reaction system. Nanoscale, 13, 10785–10791. DOI
  14. Guoshuai, J., Xiaomeng, X., Zengdan, G., Xingxing, H., Qi, P., Hanbing, Z., Yi, W. (2022) A rapid and high sensitivity RNA detection based on NASBA and G4-ThT fluorescent biosensor. Scientific Reports, 12, 10076. DOI
  15. Lu, X., Shi, X., Wu, G., Wu, T., Qin, R., Wang, Y. (2017) Visual detection and differentiation of Classic Swine Fever Virus strains using nucleic acid sequencebased amplification (NASBA) and G-quadruplex DNAzyme assay. Scientific Reports, 7, 44211. DOI
  16. Loeffler, J., Hebart, H., Cox, P., Flues, N., Schumacher, U., Einsele, H. (2001) Nucleic Acid Sequence-Based Amplification of Aspergillus RNA in Blood Samples. Journal of Clinical Microbiology, 39, 1626–1629. DOI
  17. Abd El Galil, K.H., El Sokkary, M.A., Kheira, S.M., Salazar, A.M., Yates, M.V., Chen, W., Mulchandani, A. (2005) Real-Time Nucleic Acid Sequence- Based Amplification Assay for Detection of Hepatitis A Virus. Applied and Environmental Microbiology, 71, 7113–7116. DOI
  18. Leone, G., van Schijndel, H.B., van Gemen, B., Schoen, C.D. (1997) Direct detection of potato leafroll virus in potato tubers by immunocapture and the isothermal nucleic acid amplification method NASBA. The Journal of Virological Methods, 66, 19–27. DOI
  19. Aufdembrink, L.M., Khan, P., Gaut, N.J., Adamala, K.P., Engelhart, A.E. (2020) Highly specific, multiplexed isothermal pathogen detection with fluorescent aptamer readout. RNA, 26, 1283–1290. DOI
  20. Wang, Jiasi, Kreutz, J.E., Thompson, A.M., Qin, Y., Sheen, A.M., Wang, Jingang, Wu, L., Xu, S., Chang, M., Raugi, D.N., Smith, R.A., Gottlieb, G.S., Chiu, D.T. (2018) SD-chip enabled quantitative detection of HIV RNA using digital nucleic acid sequence-based amplification (dNASBA). Lab on a Chip, 18, 3501–3506. DOI
  21. Cools, I., Uyttendaele, M., D’Haese, E., Nelis, H.J., Debevere, J., 2006. Development of a real-time NASBA assay for the detection of Campylobacter jejuni cells. Journal of Microbiological Methods 66, 313–320. https://doi. org/10.1016/j.mimet.2005.12.004
  22. Wu, Q., Suo, C., Brown, T., Wang, T., Teichmann, S., Bassett, A. (2020) INSIGHT: a scalable isothermal NASBA-based platform for COVID-19 diagnosis. BioRxiv, DOI
  23. Moll, P,R., Duschl, J., Richter, K. (2004) Optimized RNA amplification using T7-RNA-polymerase based in vitro transcription. Analytical Biochemistry, 334, 164-174. DOI
  24. Sari, Y., Sousa Rosa, S., Jeffries, J., Marques, M.P.C. (2024) Comprehensive evaluation of T7 promoter for enhanced yield and quality in mRNA production. Scientific Reports, 14, 9655. DOI
  25. Conrad, T., Plumbom, I., Alcobendas, M., Vidal, R., Sauer, S. (2020) Maximizing transcription of nucleic acids with efficient T7 promoters. Communications Biology, 3, 439. DOI
  26. Deich, C., Cash, B., Sato, W., Sharon, J., Aufdembrink, L., Gaut, N.J., Heili, J., Stokes, K., Engelhart, A.E., Adamala, K.P. (2023) T7Max transcription system. Journal of Biological Engineering, 17, 4. DOI
  27. Komura, R., Aoki, W., Motone, K., Satomura, A., Ueda, M. (2018) Highthroughput evaluation of T7 promoter variants using biased randomization and DNA barcoding. PLoS One, 13, e0196905. DOI
  28. van Beckhoven, J.R., Stead, D.E., van der Wolf, J.M. (2002) Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus by AmpliDet RNA, a new technology based on real time monitoring of NASBA amplicons with a molecular beacon. Journal of Applied Microbiology, 93, 840-849. DOI
  29. Khmeleva, S.A., Kurbatov, L.K., Ptitsyn, K.G., Timoshenko, O.S., Morozova, D.D., Suprun, E.V., Radko, S.P., Lisitsa, A.V. (2024) Detection of Potato Pathogen Clavibacter sepedonicus by CRISPR/Cas13a Analysis of NASBA Amplicons. International Journal of Molecular Sciences, 25, 12218. DOI