|
ПРОТОКОЛ ПРЕПАРАТИВНОГО ВЫДЕЛЕНИЯ ФРАКЦИЙ ЛНП И ЛВП ИЗ ПЛАЗМЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича, Россия, 119121, Москва, Погодинская ул. 10 стр. 8; *e-mail: gnedenko.oksana@gmail.com Ключевые слова: липопротеины плазмы крови; ЛОНП, ЛНП, ЛВП; высокоэффективная гель-хроматография; масс-спектрометрическая идентификация апобелков DOI: 10.18097/BMCRM00327 ВВЕДЕНИЕ Атеросклероз является основной причиной сердечно-сосудистых заболеваний, включая ишемическую болезнь сердца и инсульт, и сопровождается сужением просвета артерий из-за формирования атеросклеротических бляшек [1]. В его патогенезе участвуют липопротеины плазмы крови, которые различаются по составу белков и липидов, размеру, заряду и функциям, и по плотности делятся на липопротеины очень низкой плотности (ЛОНП), ЛНП и ЛВП [2]. Для липопротеинов разных классов, характерны маркерные апобелки, позволяющие идентифицировать соответствующую фракцию липопротеинов различными методами, среди которых ИФА [3], вестерн-блотт [4] и масс-спектрометрия [4, 5]. Существует ряд методов, позволяющих выделить аполипопротеины из биологических образцов для их дальнейшего изучения. В настоящее время для выделения липопротеинов активно используются методы хроматографии: ионообменная хроматография [6, 7], афинная хроматография [8, 9, 10], а также гель-фильтрация (SEC) [3, 5]. SEC является одним из наиболее доступных и простых методов разделения сложных смесей с сохранением нативности компонентов [11]. Широко применяется сочетание SEC и масс-спектрометрической идентификации апобелков с ортогональными методиками (ИФА, вестерн-блот, имуннотурбиметрия и т.д.) для валидации результатов масс-спектрометрии [3, 4, 5]. В данной статье мы приводим протокол препаративного выделения фракций ЛНП и ЛВП из плазмы крови человека с помощью SEC. Для определения границ зон элюции целевых аполипопротеинов мы использовали LC-MS/MS с кросс-валидацией ИФА. Полученные таким образом фракции липопротеинов могут быть использованы для различных исследований, имеющих научно-прикладное значение. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Реактивы Концентрат PBS (0.1 M фосфатный буфер, 27 мM KCl, 1.37 M NaCl) был получен от «Cytiva» (США). Tрис-(2-карбоксиэтил)-фосфин (TCEP) был получен от «Thermo Scientific» (США), 2-хлорацетамид (CAA) и аммоний бикарбонатный буфер (pH 7.8) были получены от «Sigma» (США), муравьиная кислота от «Merck Millipore» (США), вода LC–MS grade («neoFroxx GmbH», Германия), ацетонитрил LC–MS grade («Biosolve Chimie», Франция). Для определения концентраций аполипопротеинов А-1 и B-100 использовали наборы ELISA Kit for Apolipoprotein A1 и ELISA Kit for Apolipoprotein B100 («Cloud-Clone», КНР), соответственно. Остальные реактивы были получены от отечественных производителей. Плазма крови человека Кровь с антикоагулянтом (К-ЭДТА) была получена от здорового донора (поставщик ООО «АБМ»). Кровь с антикоагулянтом (К-ЭДТА) центрифугировали при 1500 g в течение 15 мин на центрифуге Heraeus Varifuge 3.0 RS («Hanau», Германия). Плазму крови человека аликвотили по 500 мкл и хранили при -40°C. Высокоэффективная гель-хроматография Разделение фракций плазмы крови проводилось на хроматографе AKTA Purifier 10 («GE Healthcare Life Sciences», США) с готовой к использованию калиброванной производителем колонкой 10/300GL, заполненной гелем Superose 6 («Cytiva», США). PBS (pH 7.4) готовили путем разведения дистиллированной водой в 10 раз концентрата, полученного от «Cytiva» (США), и добавления 0.5% NaN3. Образец плазмы крови человека инжектировали в объеме 100 мкл. Хроматографическая система работала с постоянным потоком 0.3 мл/мин на всём протяжении эксперимента. Во время процесса разделения поддерживали постоянную температуру хроматографической камеры 4◦C, элюцию контролировали по поглощению белка на 280 нм. Фракционирование начинали спустя 4.18 мл после инжекции образца, собирали фракции объёмом 500 мкл до выхода 24 мл. Хроматографическое разделение выполнялось в автоматическом режиме по следующему протоколу, записанному в управляющей программе: Column Superose_6_10/300_GL FlowRate_Equil 0.300 {ml/min} Wavelength_1 280 {nm} FlowRate_WashOut 0.300 {ml/min} Empty_loop_with 0.15 {ml} FlowRate_Elution 0.300 {ml/min} Length_Before_Frac 4.00 {ml} TubeType_EluateFrac 12mm Eluate_Frac_Size 0.500 {ml} Length_with_Frac 20.00 {ml} В каждой фракции было определено содержание общего белка методом Бредфорда с использованием планшетного ридера ClarioStar («BMG», Германия). Анализ профиля распределения липопротеинов во фракциях плазмы крови, полученных методом гель-фильтрации. Масс-спектрометрия апо-белков LC-MS/MS-анализ выполняли на масс-спектрометре micrOTOF-QII («Bruker Daltonik», Германия) с ионизацией в источнике CaptiveSpray («Bruker Daltonik», Германия), сопряжённом с системой ультраэффективной наножидкостной хроматографии nanoElute UHPLC («Bruker Daltonik», Германия). Восстановление цистеина осуществляли путём добавления в каждую фракцию, содержащую 10 мкг общего белка, раствора TCEP (10 мМ) и CAA (40 мМ) с последующей инкубацией при 37°C в течение 15 минут. Протеолиз проводили путём добавления 10 мкл раствора трипсина (20 мкг/мл) в 50 мМ аммоний бикарбонатном буфере. В случаях, когда по методу Брэдфорда содержание белка не определялось, к 200 мкл фракции добавляли 5 мкл раствора трипсина. Инкубацию образцов осуществляли при 37°C в течение 16 часов в термостате BE 400 («MEMMERT», Германия). Обессоливание образцов выполняли с использованием C18 SPE-дисков («Supelco», США). Каждый образец ресуспендировали и наносили 1 мкл на колонку-ловушку Acclaim™ PepMap™ C18 (5 мкм, 0.3×5 мм, «ThermoFisher Scientific», США), предварительно подкислив раствором 0.1% муравьиной кислоты, при давлении 400 бар. Разделение пептидов проводили на колонке Aurora Ultimate CSI C18 UHPLC (1.7 мкм, 120 Å, 75×250 мкм, «IonOpticks», Австралия) при скорости потока 300 нл/мин и температуре 50°C. Элюирование выполняли с использованием подвижных фаз: А — вода/0.1% муравьиная кислота (v/v), B — ацетонитрил/0.1% муравьиная кислота (v/v). Градиент: 2 – 45% фазы B за 40 мин, затем повышение до 95% B за 0.5 мин, удержание на уровне 95% в течение 15 мин и восстановление до 2% для следующей хроматограммы. Масс-спектрометрическая регистрация выполнялась в режиме положительных ионов со следующими параметрами: температура осушающего газа — 150°C, расход — 3 л/мин, напряжение на капилляре — 1500 В. Диапазон масс в режиме полного сканирования составлял 150–2200 m/z при скорости 2 Гц. MS/MS-анализ проводили в автоматическом режиме с фиксированным временем цикла 3 с; спектры собирались с разрешением 8–32 Гц при выборе ионов-предшественников с зарядом от +2 до +4. Обработка полученных спектров выполнялась в программном обеспечении Bruker Compass DataAnalysis 5.1 («Bruker Daltonik», Германия). Объединённый список пиков экспортировали в формате Mascot Generic Format (*.mgf) и использовали для идентификации в поисковой системе Mascot v.2.3.0 («Matrix Science», Великобритания) с базой данных SwissProt (таксон Homo sapiens). Параметры поиска: фермент — трипсин, до одного пропущенного сайта, вариабельные модификации — дезамидирование и окисление; допуск по массам — 40 ppm (MS) и 0.2 Da (MS/MS); предпочтительный заряд — от +2 до +4. Результаты идентификации экспортировали в формате CSV. Из общего списка выбирали аполипопротеины (A-1, B-100) и извлекали соответствующие значения emPAI, на основе которых строили графики распределения липоротеинов (рис. 1A, B). Иммуноферментный анализ апобелков Концентрации аполипопротеинов (А-1 для ЛВП и В-100 для ЛНП) во фракциях плазмы крови были определены с помощью иммуноферментного анализа. Для определения концентраций А-1 или B-100 образец хроматографической фракции плазмы крови разводили предварительно в 1000 или в 50 раз, соответственно. Процедуры пробоподготовки и анализа выполняли согласно инструкции производителя. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Выполнено профилирование плазмы крови человека с помощью высокоэффективной гель-хроматографии. Образец плазмы крови человека был разделён с помощью гель-фильтрации. Было собрано 30 фракций (рис. 1) объёмом 500 мкл каждая. LC-MS/MS-анализ полученных фракций позволил определить значения emPAI для апо-белков A-1 и B-100, входящих в состав ЛВП и ЛНП, соответственно (рис. 1 A и B). Соответственно полученным значениям emPAI были выбраны хроматографические фракции с преимущественным содержанием ЛВП (фракции 22-25, соответствующие преимущественному содержанию A-1) и ЛНП (фракции 15-19, соответствующие преимущественному содержанию B-100). Фракции 8-10, в которых также содержится B-100, соответствуют ЛОНП. В хроматографических фракциях плазмы крови человека c помощью ИФА было измерено содержание аполипопротеинов A-1 (маркер ЛВП) и B-100 (маркер ЛНП). Данные по распределению A-1 и B-100 в хроматографических фракциях плазмы крови человека, полученные методом ИФА, представлены на рисунке 1 С и D. Наиболее высокие концентрации B-100 были обнаружены во фракциях 13-21, а наиболее высокие концентрации A-1 - во фракциях 21-29, что согласуется с результатами масс-спектрометрического анализа. Таким образом, нами были выделены фракции ЛНП и ЛВП из плазмы крови человека и осуществлена кросс-валидация протокола определения фракций плазмы крови человека с преимущественным содержанием ЛНП или ЛВП методом LC-MS/MS.
СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ Форма информированного согласия и информационного листка доноров утверждена протоколом №309 независимого комитета по этике при ООО «Артемедассистанс» от 25.10.2023. ФИНАНСИРОВАНИЕ Работа была выполнена в рамках Программы фундаментальных научных исследований в Российской Федерации на долгосрочный период (2021 - 2030 годы) (№122030100168 2). КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. ЛИТЕРАТУРА
|
