|
Усовершенствованный способ получения низкомолекулярных субстратов тромбина – п-нитроанилидов пептидов
1Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича, Ключевые слова: хромогенные субстраты; п-нитроанилиды; твердофазный пептидный синтез; Bio-Beads SM-2; адсорбция; тромбин DOI: 10.18097/BMCRM00057 ВВЕДЕНИЕ Хромогенные субстраты ферментов часто используются для определения активностей последних с помощью фотометрических методов [1,2]. Так как данные методы широко применяются в научных исследованиях, клинической диагностике, при проведении анализов в биотехнологической промышленности, экологии и иных областях для выявления ферментов и оценки их активности, потребности в специфичных хромогенных субстратах весьма высоки, и многие из этих субстратов есть в каталогах зарубежных компаний – производителей и поставщиков реактивов. Тромбин, он же фактор свёртывания II, играет одну из ключевых ролей в процессе свертывания крови. Нарушения процесса свёртывания, вызывающие усиленную активацию тромбина, приводят к тромбозам и являются одними из основных причин развития сердечно-сосудистых заболеваний, нарушения кровообращения и кровоснабжения органов и тканей [3-5]. Связь серьезных патологий с нарушением регуляции активности тромбина требует контроля активности этого фермента. Медикаментозная регуляция повышенной свёртываемости крови также должна сопровождаться контролем активности тромбина, поскольку длительное и излишнее снижение ее может привести к опасным для жизни кровотечениям [5]. Помимо этого, разработка новых лекарственных средств, регулирующих активность тромбина, сопровождается исследованием их воздействия на кинетические параметры катализируемых тромбином реакций. Потребность в субстратах тромбина, позволяющих просто, надежно и в условиях прямой регистрации во времени определять активность этого фермента, привела к разработке ряда коротких пептидов, модифицированных по С-концевой карбоксильной группе остатками хромофора (п-нитроанилина) или флуорофора (7-амино-4-метилкумарина) [6,7]. п-Нитроанилидные субстраты ранее получали путем присоединения хромофора непосредственно к готовому пептиду либо к С-концевой аминокислоте в растворе [2,8-10], однако разработаны и более удобные т.н. one-pot способы синтеза п-нитроанилидов пептидов на твердой фазе. В ряде способов аминокислотный остаток присоединяется к смоле за функциональную группу в боковой цепи [9-11]. Это требует обязательного наличия таких остатков вблизи С-конца пептида и использования особым образом функционализированных смол, обычно не применяемых в пептидном синтезе [11,12], что весьма неудобно и непрактично. Использование связанного со смолой п-фенилендиамина позволило проводить наращивание на нем пептидной цепи с помощью стандартных методик твердофазного пептидного синтеза с последующим окислением остатка п-аминоанилида (рАА) до п-нитроанилида (pNA) в отщепленных пептидах, однако применяемые смолы подвергались дополнительным модификациям для обеспечения возможности присоединения п-фенилендиамина [13,14]. Наиболее удобным оказался способ с модификацией остатком п-фенилендиамина смолы с легко замещаемым атомом хлора (тритилхлоридной или 2-хлортритилхлоридной, обычно используемых для синтеза защищенных пептидов) с последующим наращиванием на нем пептидной цепи с помощью Fmoc-аминокислот и мягким окислением остатка п-аминоанилида до п-нитроанилида смесью персульфата и сульфата калия (Oxone®) после отщепления пептида от смолы [15]. Способ предполагал использование ВЭЖХ для одновременной очистки п-нитроанилида пептида и отделения от него окислителя. Однако нагрузка колонки для ВЭЖХ с обращенной фазой солью неорганической кислоты, к тому же являющейся окислителем, приводит к сокращению срока службы такой колонки. Кроме того, п-нитроанилиды пептидов более гидрофобны, чем п-аминоанилиды, элюируются с ВЭЖХ-колонки при достаточно высокой концентрации органической фазы и частично необратимо сорбируются, что снижает их выход и удорожает процесс получения п-нитроанилидов пептидов. Учитывая, что большинство хромогенных субстратов тромбина содержат фенильные группы (в составе остатков фенилаланина и бензойной (Bz) киcлоты), нами для замены ВЭЖХ на стадии отделения пептида от окислителя была предложена адсорбционная хроматография на носителе Bio-Beads SM-2, связывающем гидрофобные соединения и проявляющем высокую селективность в отношении соединений с фенильной группой [16]. При необходимости ВЭЖХ использовали для очистки п-аминоанилидов пептидов. Усовершенствованная методика получения п-нитроанилидов была опробована и отработана на примере синтеза субстратов тромбина Bz-Phe-Val-Arg-pNA, Bz-Val-Pro-Arg-pNA, Bz-Gly-Pro-Arg-pNA, Bz-Leu-Thr-Pro-Arg-pNA. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе были использованы следующие реактивы: 1,4-диаминобензол (п-фенилендиамин, «Реахим», Россия); хлортритильная смола (полистирол, сшитый дивинилбензолом и содержащий хлортрифенилметильные (хлортритильные) группы - TCP-Cl resin, 1,4 ммоль активных групп/г смолы, («IRIS Biotech», Германия); N,N-диметилформамид «ос.ч.» (DMFA, «ЭКОС-1», Россия); N-диизопропилэтиламин (DIPEA, «Acros», Бельгия); метанол («Acros»); дихлорметан «ос.ч.» («Компонент-реактив», Россия); N-Fmoc-L-аминокислоты: NG-2,2,4,6,7-пентаметил-дигидробензофуран-5-сульфонил-аргинин, пролин, O-трет-бутил-треонин, глицин, валин, лейцин, фенилаланин (все – «Applied Biosystems», США); 2-(1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфат (HBTU, «ChemPep», США); 1-гидроксибензотриазол (НОВТ, «Fluka», Швейцария), 2,4,6-триметилпиридин (симм-коллидин, «Sigma-Aldrich», США); 4-метилпиперидин («Acros»); бензоилхлорид («Fluka»); трифторуксусная кислота (TFAA, «Acros»); триизопропилсилан (TIS, «Acros»); диэтиловый эфир («Реаторг», Россия); диметилсульфоксид (DMSO, «Acros»); ацетонитрил для ВЭЖХ («BioSolve», США); Oxone® («Acros»); тромбин лиофилизированный из набора Tissucol® Kit, 500 МЕ («Baxter AG», Австрия), полистирольный носитель для адсорбционной хроматографии Bio-Beads SM-2 («Bio-Rad Laboratories», США). п-Аминоанилид-модифицированную смолу получали по методике [14]: к раствору свежеочищенного сублимацией в вакууме п-фенилендиамина (1.82 г, 16.8 ммоль) в сухом DMFA (15 мл) при 0°C добавили тритилхлоридную смолу (1.50 г, 2.1 ммоль), затем DIPEA (2.93 мл, 16.8 ммоль) и оставили на 6 ч при комнатной температуре. По окончании реакции смолу отфильтровали, промыли на фильтре метанолом (5 × 20 мл), дихлорметаном (5 × 20 мл) и высушили под вакуумом. п-Аминоанилиды N-замещенных пептидов получали автоматическим твердофазным пептидным синтезом на синтезаторе 433A («Applied Biosystems») по программе FastMoc в масштабе 0.25 ммолей с использованием 4-кратного избытка (по отношению к количеству остатков п-фенилендиамина на смоле) соответствующих аминокислот и HBTU/НОВТ/симм-коллидина как активаторов (1/1/2 экв. по отношению к Fmoc-аминокислотам) в DMFA, с однократным присоединением каждого аминокислотного остатка. Защитные Fmoc-группы с N-конца растущей пептидной цепи удаляли обработкой 20%-ным 4-метилпиперидином в DMFA. Присоединение остатка бензойной кислоты проводили, используя смесь бензоилхлорида (4 экв.) с DIPEA (4 экв.). Синтезированные пептиды снимали со смолы с одновременным деблокированием боковых функциональных групп аминокислот смесью 95% TFAA, 2.5% TIS и 2.5% воды (15 мл смеси на 1 г смолы) в течение 2 ч. Растворы пептидов упаривали в вакууме до минимального объема и осаждали пептиды холодным диэтиловым эфиром. Осадки пептидов растворяли в минимальном объеме DMSO и очищали с помощью ВЭЖХ на обращенной фазе (колонка Zorbax 300SB-C8 5 µm 21.2x250 mm, рабочая станция Agilent 1100, США) с элюцией градиентом концентрации ацетонитрила в воде в присутствии 0,1% TFAA, скорость элюции 15 мл/мин. Полученные фракции очищенных п-аминоанилидов пептидов объединяли, упаривали под вакуумом до полного удаления ацетонитрила. При выпадении пептидов в осадок добавляли деионизованную воду до полного растворения пептида, после чего добавляли ещё воды в объеме, равном 50% общего объема раствора (для предотвращения выпадения в осадок образующихся при окислении п-нитроанилидов). Общая методика окисления и последующей очистки субстратов. К водным растворам полученных п-аминоанилидов пептидов добавляли не менее 6 экв. Oxone® (смесь сульфата и персульфата калия, 1:1 по массе). Полученную смесь перемешивали 6 ч при комнатной температуре, после чего к ней добавляли 1 г Bio-Beads SM-2 и перемешивание продолжали еще 6-10 ч. Сорбент отфильтровывали на фильтре Шотта и промывали водой (5×10 мл воды) до отрицательной реакции с насыщенным раствором BaCl2. Элюцию пептида с сорбента проводили ацетонитрилом («BioSolve», 3×10 мл), элюат упаривали под вакуумом. Полученные п-нитроанилиды пептидов анализировали высокоэффективной жидкоствной хроматографией (ВЭЖХ, колонка 2.1×50 мм YMC Triart C18, 1.9 мкм («YMC», Швейцария), градиент ацетонитрила 2-98% в воде с 0.1% муравьиной кислоты и 0.01% TFAA, объем нанесения 1 мкл, скорость элюции 0.3 мл/мин) с УФ- (210 нм) и масс-спектрометрической (ионизация электрораспылением, детектор - ионная ловушка) детекцией, растворяли в деионизованной воде и лиофилизовали. Гидролиз полученных субстратов под действием тромбина регистрировали по изменению во времени оптической плотности раствора при 405 нм на планшетном спектрофотометре MultiScan Spectrum («Thermo Fisher Scientific», США), коэффициент молярной экстинкции п-нитроанилина ε405 = 9800 М-1см-1 [8]. Реакции проводили при 37°C при перемешивании в лунках полистирольных планшетов с низкой сорбционной активностью Cliniscan («Labsystems», Финляндия) в буферном растворе, содержавшем 20 мМ HEPES, 140 mM NaCl, 0.1% ПЭГ 6000, pH 8.0, при концентрациях субстратов 4-200 мкМ, объем реакционной пробы 200 мкл, длина оптического пути 5 мм. Реакцию запускали после стабилизации скорости спонтанного гидролиза субстрата добавлением 10 мкл раствора тромбина (конечная концентрация в лунке 0.5 МЕ/мл). Начальную скорость гидролиза субстрата под действием тромбина определяли по отрезку кинетической кривой, соответствующему степени гидролиза не более 10% субстрата. Кинетические параметры каталитических реакций рассчитывали из зависимостей скоростей реакций от концентраций субстратов в координатах Лайнуивера-Берка с помощью программы Origin 9.1 («OriginLab Corporation», США). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Как известно, методика твердофазного синтеза пептидов позволяет значительно упростить и автоматизировать основные стадии синтетического цикла. В то же время довольно затруднительно получить производные пептидов, замещенные по C-концу, поскольку он необходим для присоединения к полимерному носителю. Ранее на примере п-нитроанилидов пептидов была предложена концепция присоединения к твердофазному носителю предшественника хромофора в начале синтеза с последующим наращиванием полипептидной цепи [13-15]. п-Нитроанилин является одним из наиболее востребованных хромофоров и легко получается из п-аминоанилина (п-фенилендиамина) мягким окислением перборатом [13] или смесью персульфата и сульфата калия (Oxone®) [15]. п-Фенилендиамин является гомобифункциональным реагентом, то есть может быть легко встроен в качестве линкера между смолой и пептидом. Для дальнейшего наращивания пептидной цепи используются обычные методы твердофазного пептидного синтеза, а после снятия пептида со смолы остаток п-аминоанилина окисляется до п-нитроанилида. Присоединение п-фенилендиамина к тритилхлоридной смоле (обычно используемой для синтеза защищенных по боковым функциональным группам пептидов) путем алкилирования взятого в избытке амина тритильной группой проходит с высокой эффективностью: по данным элементного анализа полученного нами препарата модифицированной смолы на содержание азота степень модификации смолы составила не менее 90%. Для автоматического твердофазного синтеза п-аминоанилидов пептидов была применена стандартная методика с использованием в качестве активаторов урониевых солей в присутствии 1-гидроксибензотриазола. Полученные твердофазным синтезом п-аминоанилиды пептидов Bz-FVR, Bz-VPR, Bz-LTPR были очищены препаративной ВЭЖХ на октил-силикагеле и после упаривания ацетонитрила подвергнуты в водном растворе окислению Oxone® до п-нитроанилидов. п-Аминоанилид Bz-GPR после синтеза имел степень чистоты по данным аналитической ВЭЖХ с масс-спектрометрической детекцией не ниже 90%, и его с помощью ВЭЖХ не очищали (см. ниже). В работе [15] п-аминоанилиды пептидов не подвергали очистке на ВЭЖХ, хотя описанные в ней препараты, как и полученные нами (см. рис. Д1-Д4 в Дополнительных материалах), содержали некоторое количество примесей, а очищали ВЭЖХ полученные окислением п-нитроанилиды одновременно с обессоливанием. Однако п-нитроанилиды элюируются с колонки с октил-силикагелем при более высокой концентрации ацетонитрила, чем п-аминоанилиды, что означает повышенный расход дорогого органического растворителя, а примеси в виде целевых соединений с неснятыми защитными группами в случае п-нитроанилидов могут связываться практически необратимо и загрязнять колонку. Кроме того, после окисления в препаратах п-нитроанилидных субстратов присутствуют довольно большие количества Oxone®, который при постоянном хроматографировании содержащих его растворов мог нанести непоправимый ущерб материалам хроматографической системы (коррозия, выпадение осадков, модификация носителя). Результаты анализа п-нитроанилидов пептидов (рис. Д5-Д8 в Дополнительных материалах) показывают, что окисление п-аминоанилидов до п-нитроанилидов происходит количественно: в препаратах п-нитроанилидов примесей п-аминоанилидов не обнаружено. Очистка конечных препаратов целевых пептидов представляет собой обессоливание. Так как синтезированные пептиды имеют небольшие молекулярные массы, использование гель-фильтрации для этой цели невозможно. Наилучшим вариантом является адсорбция на носителе, селективно и прочно сорбирующем полученные нами весьма гидрофобные п-нитроанилидные субстраты и легко десорбирующем их после отмывки от окислителя. В качестве носителя для адсорбции полученных п-нитроанилидов пептидов был выбран полистирольный носитель Bio-Beads SM-2, проявляющий высокую селективность в отношении адсорбции гидрофобных соединений, и особенно соединений с фенильными группами [16]. Поскольку все синтезированные нами субстраты тромбина содержали фенильные группы в составе остатков бензойной кислоты, можно было полагать, что Bio-Beads SM-2 будет пригоден для очистки указанных субстратов, причем по инструкции производителя его можно использовать в режиме сорбции из объема. Действительно, после окисления 20.0 мг Bz-LTPR-pАA с последующей очисткой на Bio-Beads SM-2 сорбцией из объема и элюцией ацетонитрилом получено 18.4 мг Bz-LTPR-pNA, что соответствует выходу 88% от теоретического на данной стадии, а после окисления 20.0 мг Bz-FVR-pAA с последующей очисткой на Bio-Beads SM-2 – 14.2 мг Bz-FVR-pNA (выход 71% от теоретического на стадии обессоливания). Эти результаты означают, что полученные п-нитроанилиды пептидов эффективно сорбируются из водного раствора на Bio-Beads SM-2 и достаточно полно элюируются полярным растворителем. Меньший выход субстрата Bz-FVR-pNA может быть связан с его более низкой растворимостью в воде: часть субстрата могла осесть после окисления на стенках колбы и не сорбироваться на носитель. Выходы остальных пептидов на стадии окисления и последующей очистки на Bio-Beads SM-2 не проверяли, поскольку это требовало дополнительной длительной сушки п-аминоанилидов пептидов в вакууме, усложняющей методику. Однако, судя по величинам выходов п-нитроанилидов пептидов (в % от теоретических, табл. 1), рассчитанных для процесса в целом для каждого субстрата, выходы субстратов на стадии окисления и последующей очистки на Bio-Beads SM-2 составляют не менее 70% от теоретических.
В целом выходы полученных нами очищенных п-нитроанилидных субстратов тромбина такие же или немного выше выходов п-нитроанилидов пептидов, описанных в работе [15]. Субстрат тромбина Bz-GPR-pNA, содержавший в качестве минорных примесей не бензоилированный пептид-п-нитроанилид и побочные продукты реакции снятия пептида со смолы и удаления защитных групп, был получен в виде высокоочищенного препарата без очистки ВЭЖХ в виде п-аминоанилида; указанные примеси были удалены при одновременном обессоливании пептида адсорбцией на Bio-Beads SM-2. Полученные нами п-нитроанилидные субстраты тромбина были испытаны на способность гидролизоваться при катализе тромбином, определены кинетические параметры ферментативного гидролиза (табл. 2 и рис. Д9).
Величины Vmax/KM бензоилированных п-нитроанилидных субстратов тромбина прямо пропорциональны величинам kcat/KM субстратов с такими же аминокислотными последовательностями, но тозилированных по N-концу, а значение KM синтезированных нами субстратов близки к известным из литературы значениям KM ферментативного гидролиза п-нитроанилидных субстратов тромбина, полученных синтезом в растворе [8]. Это косвенно свидетельствует об идентичности структур п-нитроанилидных субстратов, полученных ранее синтезом в растворе и твердофазным синтезом ЗАКЛЮЧЕНИЕ Замена очистки конечных продуктов, п-нитроанилидов пептидов, методом ВЭЖХ на очистку полупродуктов – п-аминоанилидов – и последующее обессоливание п-нитроанилидов адсорбцией на Bio-Beads SM-2 позволило исключить повреждающее воздействие на оборудование и расходные материалы для ВЭЖХ при получении п-нитроанилидных субстратов тромбина, снизить расход ацетонитрила и повысить выход конечных продуктов. Следует отметить, что в случае получения после твердофазного синтеза достаточно чистого препарата пептид-п-аминоанилида его очистка методом ВЭЖХ необязательна, если присутствующие примеси после окисления Oxone® могут быть удалены при параллельном обессоливании адсорбцией на Bio-Beads SM-2. БЛАГОДАРНОСТИ Авторы благодарны Н.А. Казьминой и А.В. Колесниченко за отличную техническую помощь. Элементный анализ п-фенилендиамин-модифицированной смолы был выполнен в ИОХ РАН. Синтез пептидов проводили с использованием оборудования ЦКП "Протеом человека" ИБМХ, поддержанного Минобрнауки России в рамках выполнения соглашения № 14.621.21.0017 (уникальный идентификатор проекта RFMEFI62117X0017). Работа выполнена в рамках Программы фундаментальных научных исследований государственных академий наук на 2013-2020 годы. ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ К данной статье приложены дополнительные материалы, свободно доступные в электронной версии (http://dx.doi.org/10.18097/BMCRM00057) на сайте журнала. ЛИТЕРАТУРА
|
