Валидация протокола пробоподготовки на основе 1DE-гель концентрирования для протеомного анализа клеточной культуры HepaRG

##plugins.themes.bootstrap3.article.sidebar##

pdf Supplementary (English)
Опубликован: May 28, 2026
DOI: https://doi.org/10.18097/BMCRM00290
Ключевые слова:
HepaRG; ВМ-3 (бифункциональный белок, объединяющий цитохром P450 и NADPH-цитохром P450 редуктазу, cyp102A1); 1DE-гель концентрирование; LC-MS/MS; IdentiProt; белки метаболизма

##plugins.themes.bootstrap3.article.main##

Н.А. Болоченков
Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В. Н. Ореховича, 119121, Москва, ул. Погодинская, 10
Д.Д. Ромашин
Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В. Н. Ореховича, 119121, Москва, ул. Погодинская, 10
Л.Ш. Казиева
Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В. Н. Ореховича, 119121, Москва, ул. Погодинская, 10
Ю.С. Кисриева
Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В. Н. Ореховича, 119121, Москва, ул. Погодинская, 10
Н.Ф. Саменкова
Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В. Н. Ореховича, 119121, Москва, ул. Погодинская, 10
А.Л. Русанов
Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В. Н. Ореховича, 119121, Москва, ул. Погодинская, 10
И.И. Карузина
Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В. Н. Ореховича, 119121, Москва, ул. Погодинская, 10
А.В. Лисица
Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В. Н. Ореховича, 119121, Москва, ул. Погодинская, 10
Н.А. Петушкова
Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В. Н. Ореховича, 119121, Москва, ул. Погодинская, 10

Аннотация

HepaRG — перспективная модель клеток печени человека, которую используют для изучения механизмов воздействия лекарственных средств. В данной работе сравнивали два метода подготовки образцов для протеомного профилирования клеток HepaRG: (1) экстракцию белков буфером RIPA на основе додецилсульфата натрия с последующим 1DE-гель концентрированием и трипсинолизом в геле (протокол 1), (2) экстракцию белков буфером на основе мочевины/тиомочевины с последующим трипсинолизом в растворе (протокол 2). Эффективность трипсинолиза оценивали с помощью внешнего стандарта — рекомбинантного цитохрома P450 BM3 из бактерии Bacillus megaterium. Поиск пептидов и белков проводили с помощью поисковой протеомной машины IdentiProt. Трипсинолиз в геле (протокол 1) позволил идентифицировать 82.7 ± 1.5 пептидов BM-3, тогда как с помощью трипсинолиза в растворе (протокол 2) было идентифицировано 76.0 ± 0.0 пептидов, что составило в среднем 49.8% и 45.8% от теоретически возможного количества соответственно. Обе методики продемонстрировали высокую корреляцию (r = 0.84, p < 0.05) между значениями интенсивности зарегистрированных пептидов BM3. Было идентифицировано 8487 ± 235 пептидов и 1242 ± 22 белков HepaRG (протокол 1), 9415 ± 276 пептидов и 1478 ± 34 белков (протокол 2). Анализ идентифицированных белков показал, что оба протокола позволили идентифицировать белки в диапазоне молекулярных масс 6–629 кДа, 75% которых находилась в пределах 10–100 кДа. Таким образом, обе методики пробоподготовки показали сопоставимые результаты для характеристики протеома клеток линии гепатомы человека HepaRG и поиска белков, участвующих в метаболизме ксенобиотиков и лекарственных средств.

##plugins.themes.bootstrap3.article.details##

Как цитировать
Болоченков N., Ромашин D., Казиева L., Кисриева I., Саменкова N., Русанов A., Карузина I., Лисица A., & Петушкова N. (2026). Валидация протокола пробоподготовки на основе 1DE-гель концентрирования для протеомного анализа клеточной культуры HepaRG. Biomedical Chemistry: Research and Methods, 9(2), e00290. https://doi.org/10.18097/BMCRM00290
Выпуск
Том 9 № 2 (2026): Принято в печать
Раздел
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Библиографические ссылки

  1. Guguen-Guillouzo, C., Guillouzo, A. (2010) General review on in vitro hepatocyte models and their applications. Methods Mol. Biol., 640, 1–40. DOI
  2. LeCluyse, E.L. (2001) Human hepatocyte culture systems for the in vitro evaluation of cytochrome P450 expression and regulation. Eur. J. Pharm. Sci., 13, 343–368. DOI
  3. Hart, S.N., Li, Y., Nakamoto, K., Subileau, E.A., Steen, D., Zhong, X.B. (2010) A comparison of whole genome gene expression profiles of HepaRG cells and HepG2 cells to primary human hepatocytes and human liver tissues. Drug Metab. Dispos., 38(6), 988–994. DOI
  4. Andersson, T.B., Kanebratt, K.P., Kenna, J.G. (2012) The HepaRG cell line: A unique in vitro tool for understanding drug metabolism and toxicology in humans. Expert Opin. Drug Metab. Toxicol., 8, 909–920. DOI
  5. Tascher, G., Burban, A., Camus, S. (2019). In-Depth Proteome Analysis Highlights HepaRG Cells as a Versatile Cell System Surrogate for Primary Human Hepatocytes. Cells,. 8(2), 192. DOI
  6. Kanebratt, K.P., Andersson, T.B. (2008) Evaluation of HepaRG cells as an in vitro model for human drug metabolism studies. Drug Metab. Dispos., 36(7), 1444–1452. DOI
  7. Rogers, J.C., Bomgarden, R.D. (2016) Sample preparation for mass spectrometry-based proteomics; From proteomes to peptides. Adv. Exp. Med. Biol., 919, 43–62. DOI
  8. Loo, R.R., Dales, N., Andrews, P.C. (1996) The effect of detergents on proteins analyzed by electrospray ionization. Methods Mol Biol., 61, 141–160. DOI
  9. Olsen, J.V., Ong, S.E., Mann, M. (2004) Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Mol. Cell Proteomics., 3(6), 608–614. DOI
  10. Shkrigunov, T., Pogodin, P., Zgoda, V., et al. (2022) Protocol for increasing the sensitivity of MS-based protein detection in human chorionic villi. Current Issues in Molecular Biology. 44(5), 2069–2088. DOI
  11. Walker, J.M. (1994) The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods Mol. Biol., 32, 5–8. DOI
  12. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J.V., Mann, M. (2006) In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols, 1(6), 2856–2860. DOI
  13. Levitsky, L.I., Ivanov, M.V., Lobas, A.A., et al (2018) IdentiPy: An extensible search engine for protein identification in shotgun proteomics. J. Proteome Res., 17(7), 2249–2255. DOI
  14. Lisitsa, A. V., Petushkova, N. A., Levitsky, L. I. et al. (2019) Comparative analysis of the perfomance of Mascot and IdentiPy algorithms on a benchmark dataset obtained by tandem mass spectrometry analysis of testicular biopsea. Molecular Biology, 53(1), 166-176. DOI 10.1134/S0026898419010099
  15. Spearman, C. (1904) The proof and measurement of association between two things. Am. J. Psychol. 15(1), 72–101. DOI
  16. Petushkova, N.; Bolochenkov, N; Romashin, D. et al (2025) The validation of sample preparation protocols for MS-based proteins detection in HepaRG cells, Mendeley Data, V2, DOI
  17. Shkrigunov, T., Kisrieva, Y., Samenkova, N. et al (2022) Comparative proteoinformatics revealed the essentials of SDS impact on HaCaT keratinocytes. Scientific Reports, 12(1), 21437. DOI
  18. Sipos, T., Merkel, J.R. (1970) An effect of calcium ions on the activity, heat stability, and structure of trypsin. Biochemistry. 9(14), 2766–2775. DOI
  19. Gomes, F.A., Souza, Jr. D.R., Massafera, M.P., Ronsein, G.E. (2024) Robust assessment of sample preparation protocols for proteomics of cells and tissues. Biochim. Biophys. Acta Proteins Proteom. 1872(5). DOI
  20. Ceelen, L., De Spiegelaere, W., David, M., De Craene, J., Vinken, M., Vanhaecke, T., Rogiers, V. (2011) Critical selection of reliable reference genes for gene expression study in the HepaRG cell line. Biochem. Pharmacol. 81(10), 1255-61. DOI
  21. Brzeszczyńska, J., Brzeszczyński, F., Samuel, K., Morgan, K., Morley, S.D., Plevris, J.N., Hayes, P.C. (2020) Validation of reference genes for gene expression studies by rt-qpcr in heparg cells during toxicity testing and disease modelling. Cells, 9(3), 770 DOI
  22. Pflug, S, Richter, SM, Urlacher, VB. (2007) Development of a fed-batch process for the production of the cytochrome P450 monooxygenase CYP102A1 from Bacillus megaterium in E. coli. J. Biotechnol. 129(3), 481-8. DOI
  23. Hildonen, S, Halvorsen, TG and Reubsaet, L. (2014) Why less is more when generating tryptic peptides in bottom-up proteomics. Proteomics, 14: 2031- 2041. DOI
  24. León, IR, Schwämmle, V, Jensen, ON, Sprenger, RR. (2013) Quantitative assessment of in-solution digestion efficiency identifies optimal protocols for unbiased protein analysis. Mol. Cell. Proteomics. 12(10): 2992-3005. DOI
  25. Betancourt LH, Sanchez A, Pla I, Kuras M, Zhou Q, Andersson R, Marko- Varga G. (2018) Quantitative Assessment of Urea In-Solution Lys-C/Trypsin Digestions Reveals Superior Performance at Room Temperature over Traditional Proteolysis at 37 °C. J. Proteome. Res. 17(7), 2556-2561. DOI