Влияние глубины секвенирования на количество вариантов сплайсинга транскриптов, выявленное с помощью нанопорового секвенатора MinION

##plugins.themes.bootstrap3.article.sidebar##

pdf (English)
Опубликован: Dec 8, 2025
DOI: https://doi.org/10.18097/BMCRM00300
Ключевые слова:
нанопоровое секвенирование; транскрибируемые гены; сплайс-варианты транскриптов; глубина секвенирования

##plugins.themes.bootstrap3.article.main##

К.Г. Птицын
Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В. Н. Ореховича, 119121, Москва, ул. Погодинская, 10
А.С. Козлова
Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В. Н. Ореховича, 119121, Москва, ул. Погодинская, 10
С.А. Хмелева
Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В. Н. Ореховича, 119121, Москва, ул. Погодинская, 10
Л.К. Курбатов
Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В. Н. Ореховича, 119121, Москва, ул. Погодинская, 10
С.П. Радько
Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В. Н. Ореховича, 119121, Москва, ул. Погодинская, 10
Е.В. Ильгисонис
Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В. Н. Ореховича, 119121, Москва, ул. Погодинская, 10
А.В. Лисица
Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В. Н. Ореховича, 119121, Москва, ул. Погодинская, 10
Е.А. Пономаренко
Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В. Н. Ореховича, 119121, Москва, ул. Погодинская, 10

Аннотация

Альтернативный сплайсинг (АС) первичной мРНК является фундаментальным регуляторным процессом, связанным с физиологией и патологией. Секвенирование РНК длинными прочтениями с использованием нанопорового секвенатора, такого как ONT MinION, позволяет проводить прямое профилирование АС. В настоящей работе было исследовано влияние глубины секвенирования на количество транскрибируемых генов и общее количество вариантов транскриптов (вариантов сплайсинга), выявляемых с помощью секвенирования с использованием MinION. Это важно для профилирования АС с точки зрения сопоставимости данных, полученных для разных биообразцов в отдельных секвенированиях. Глубина секвенирования выражалась как количество картированных «прочтений», полученных в каждом секвенировании с использованием секвенатора MinION. В качестве модельных объектов были использованы образцы ткани печени человека и клеточные линии гепатоцитарного происхождения HepG2 и Huh7. Было обнаружено, что количество обнаруженных генов и транскриптов существенно зависит от глубины секвенирования. В то время как количество детектируемых генов достигало плато на уровне примерно 12 тысяч, когда количество «прочтений» превышало 1.2 миллиона, количество выявленных транскриптов неуклонно росло до примерно 20 тысяч сплайс-вариантов при самом высоком показателе в 2.3 миллиона «прочтений», достигнутом в ходе исследования. При данном количестве «простений» отношение числа выявленных транскриптов к числу генов было немного ниже 1.7. Для достижения уровня в 1.8 транскриптов (вариантов сплайсинга) на ген, ожидаемого из известного количества аннотированных генов и транскриптов для генома человека, при проведении секвенирования с использованием MinION потребуется получение более 2.3 миллионов высококачественных картированных «прочтений». Данные секвенирования, использованные в исследовании, были получены для гепатоцитов и клеток гепатоцитарного происхождения и для их обобщения потребуется анализ данных нанопорового секвенирования для других типов клеток и тканей.

##plugins.themes.bootstrap3.article.details##

Как цитировать
Птицын K., Козлова A., Хмелева S., Курбатов L., Радько S., Ильгисонис E., Лисица A., & Пономаренко E. (2025). Влияние глубины секвенирования на количество вариантов сплайсинга транскриптов, выявленное с помощью нанопорового секвенатора MinION. Biomedical Chemistry: Research and Methods, 8(4), e00300. https://doi.org/10.18097/BMCRM00300
Выпуск
Том 8 № 4 (2025): Принято в печать
Раздел
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Библиографические ссылки

  1. Gilbert, W. (1978) Why genes in pieces? Nature, 271(5645), 501. DOI
  2. Su, T., Hollas, M.A.R., Fellers, R.T., Kelleher, N.L. (2023) Identification of splicevariants and isoforms in transcriptomics and proteomics. Annual Review of Biomedical Data Science, 6, 357-376. DOI
  3. Wright, C.J., Smith, C.W.J., Jiggins, C.D. (2022) Alternative splicing as a source of phenotypic diversity. Nature Reviews Genetics, 23(11), 697-710. DOI
  4. Montes, M., Sanford, B.L., Comiskey, D.F., Chandler, D.S. (2019) RNA splicing and disease: animal models to therapies. Trends in Genetics, 35(1), 68- 87. DOI
  5. Nilsen, T.W., Graveley, B.R. (2010) Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing. Nature, 463(7280), 457-63. DOI
  6. Jiang, W., Chen, L. (2020) Alternative splicing: human disease and quantitative analysis from high-throughput sequencing. Computational and Structural Biotechnology Journal, 19, 183-195. DOI
  7. Stark, R., Grzelak, M., Hadfield, J. (2019) RNA sequencing: the teenage years. Nature Reviews Genetics, 20(11), 631-656. DOI
  8. Zhang, Z., So, K., Peterson, R., Bauer, M., Ng, H., Zhang, Y., Kim, J.H., Kidd, T., Miura, P. (2019) Elav-mediateexon skipping and alternative polyadenylation of the Dscam1 gene are required for axon outgrowth. Cell Reports, 27(13), 3808-3817.e7. DOI
  9. Moldovan, N., Torma, G., Gulyas, G., Hornyak, A., Zadori, Z., Jefferson, V.A., Csabai, Z., Boldogkoi, M., Tombacz, D., Meyer, F., Boldogkoi, Z. (2020) Time-course profiling of bovine alphaherpesvirus 1.1 transcriptome using multiplatform sequencing. Scientific Reports, 10(1), 20496. DOI
  10. Xin, H., He, X., Li, J., Guan, X., Liu, X., Wang, Y., Niu, L., Qiu, D., Wu, X., Wang, H. (2022) Profiling of the full-length transcriptome in abdominal aortic aneurysm using nanopore-based direct RNA sequencing. Open Biology, 12(2), 210172. DOI
  11. Deynichenko, K.A., Ptitsyn K.G., Radko, S.P., Kurbatov, L.K., Vakhrushev, I.V., Buromski, I.V., Markin, S.S., Archakov, A.I., Lisitsa, A.V., Ponomarenko, E.A. (2022) Splice variants of mRNA of cytochrome P450 genes: analysis by the nanopore sequencing method in human liver tissue and HepG2 cell line. Biomeditsinskaya Khimiya, 68(2), 117-125. DOI
  12. Wu, H., Lu, Y., Duan, Z., Wu, J., Lin, M., Wu, Y., Han, S., Li, T., Fan, Y., Hu, X., Xiao, H., Feng, J., Lu, Z., Kong, D., Li, S. (2023) Nanopore long-read RNA sequencing reveals functional alternative splicing variants in human vascular smooth muscle cells. Communications Biology, 6(1), 1104. DOI
  13. Soneson, C., Love, M.I., Robinson, M.D. (2015) Differential analyses for RNA-seq: transcript-level estimates improve gene-level inferences. F1000Research, 4, 1521. DOI
  14. Zhang, C., Zhang, B., Lin, L.L., Zhao, S. (2017) Evaluation and comparison of computational tools for RNA-seq isoform quantification. BMC Genomics, 18(1), 583. DOI
  15. Hussain, S. (2018) Native RNA-sequencing throws its hat into the transcriptomics ring. Trends in Biochemical Sciences, 43(4), 225-227. DOI
  16. Wadsworth, M.E., Page, M.L., Aguzzoli Heberle, B., Miller, J.B., Steely, C., Ebbert, M.T.W. (2025) Sequencing the gaps: dark genomic regions persist in CHM13 despite long-read advances. bioRxiv [Preprint]. DOI
  17. Yao, T., Zhang, Z., Li, Q., Huang, R., Hong, Y., Li, C., Zhang, F., Huang, Y., Fang, Y., Cao, Q., Jin, X., Li, C., Wang, Z., Lin, X.J., Li, L., Wei, W., Wang, Z., Shen, J. (2023) Long-Read Sequencing Reveals Alternative Splicing- Driven, Shared Immunogenic Neoepitopes Regardless of SF3B1 Status in Uveal Melanoma. Cancer Immunology Research, 11(12), 1671-1687. DOI
  18. Halstead, Islas-Trejo, M.M., Goszczynski, D.E., Medrano, J.F., Zhou, H., Ross, P.J. (2021) Large-Scale Multiplexing Permits Full-Length Transcriptome Annotation of 32 Bovine Tissues From a Single Nanopore Flow Cell. Frontiers in Genetics, 12, 664260. DOI
  19. Sarygina, E., Kozlova, A., Deinichenko, K., Radko, S., Ptitsyn, K., Khmeleva, S., Kurbatov, L.K., Spirin, P., Prassolov, V.S., Ilgisonis, E., Lisitsa, A., Ponomarenko, E. (2023) Principal component analysis of alternative splicing profiles revealed by long-read ONT sequencing in human liver tissue and hepatocyte-derived HepG2 and Huh7 cell lines. International Journal of Molecular Sciences, 24(21), 15502. DOI
  20. Kozlova, A. Sarygina, E., Deinichenko, K., Radko, S., Ptitsyn, K., Khmeleva, S., Kurbatov, L., Spirin, P., Prassolov, V., Ilgisonis, E., Lisitsa, A., Ponomarenko, E. (2023) Comparison of alternative splicing landscapes revealed by long-read sequencing in hepatocyte-derived HepG2 and Huh7 cultured cells and human liver tissue. Biology (Basel), 12(12), 1494. DOI
  21. Zhao, S., Ye, Z., Stanton, R. (2020) Misuse of RPKM or TPM normalization when comparing across samples and sequencing protocols. RNA, 26(8), 903-909. DOI
  22. Schwenk, V., Leal Silva, R.M., Scharf, F., Knaust, K., Wendlandt, M., Häusser, T., Pickl, J.M.A., Steinke-Lange, V., Laner, A., Morak, M., Holinski- Feder, E., Wolf, D.A. (2023) Transcript capture and ultradeep long-read RNA sequencing (CAPLRseq) to diagnose HNPCC/Lynch syndrome. Journal of Medical Genetics, 60(8), 747-759. DOI
  23. Shapovalova, V., Radko, S., Ptitsyn, K., Krasnov, G., Nakhod, K., Konash, O., Vinogradina, M., Ponomarenko, E., Druzhilovskiy, D., Lisitsa, A. (2020) Processing oxford nanopore long readsusing amazon web services. Biomedical Chemistry: Research and Methods, 3(4), e00131. DOI
  24. Lanfear, R., Schalamun, M., Kainer, D., Wang, W., Schwessinger, B. (2019) MinIONQC: fast and simple quality control for MinION sequencing data. Bioinformatics, 35(3), 523-525. DOI
  25. Li, H. (2018) Minimap2: pairwise alignment for nucleotide sequences. Bioinformatics, 34(18), 3094-3100. DOI
  26. Pyatnitskiy M.A., Arzumanian V.A., Radko S.P., Ptitsyn K.G., Vakhrushev I.V., Poverennaya E.V., Ponomarenko E.A. (2021) Oxford nanopore MinION direct RNA-Seq for systems biology. Biology (Basel), 10(11), 1131. DOI